摘要
睡眠对保持身心健康至关重要。睡眠不足或睡眠中断会增加包括心血管疾病在内的多种疾病的发生风险，但睡眠对维持心血管健康的细胞和分子机制却知之甚少。本研究发现，睡眠具有调控小鼠造血作用和防止动脉粥样硬化进展的作用。睡眠片段化可导致小鼠骨髓产生较多的Ly-6Chigh单核细胞，粥样病变面积增加，下视丘分泌素（下丘脑外侧的一种刺激和促进觉醒的神经肽）的表达减少。下视丘分泌素通过其受体抑制骨髓前体中性粒细胞分泌CSF1，从而抑制髓系细胞生成。而抑制造血细胞来源CSF1或添加下视丘分泌素可抑制睡眠片段化导致的循环单核细胞增加粥样病变区域增大。总之，本研究结果提示了一个将睡眠与造血和动脉粥样硬化联系起来的神经-免疫系统轴。
前言
睡眠不足已经成为日益严重的公共卫生问题。美国近一半的成年人每天的睡眠时间低于建议的7-8小时。睡眠不足会增加患肥胖、糖尿病、癌症和心血管疾病的风险，但我们对睡眠与疾病之间的潜在机制却知之甚少。
Sleepfragmentation(SF)：睡眠片段化
CSF1：集落刺激因子-1
Leukocytosis：白细胞增多
ZT：授时因子时间
Hcrt：下视丘分泌素，也称为orexin
Hcrtr1：下视丘分泌素受体1
技术路线图
方法
动物
体内干预
饮食
给予Apoe-/-小鼠高脂肪饮食（HDF，HarlanTeklad，TD.），Ldlr-/-小鼠给予喂食高胆固醇饮食（HCD，研究饮食，D）。
睡眠片段化
睡眠片段化装置用于进行小鼠的睡眠片段化研究，在进行特殊喂养的同时将小鼠放入该装置内，底部皮带在光照期间（ZT0-12)每两分钟运行一次，底部皮带运行在黑暗期间（ZT12-24）自动停止。
干预
对于hypocretin添加实验，在实验开始8周后，通过在小鼠皮下植入渗透微型泵（Alzet)，在实验的第8至16周期间以50nmol/h/kg给予高脂膳食的Apoe-/-对照组和睡眠片段化干预组小鼠补充hypocretin-1或生理盐水。小鼠被随机分配至生理盐水组或hypocretin-1组。四周后更换微型泵。
联体共生模型
剃除小鼠左侧（或右侧）体毛，固定于手术台上。碘伏消毒后，取胸腹部侧切口，上至前肢关节，下至后肢关节，剪开腹壁，注意保护肠管。将两只小鼠的前肢及后肢关节连接，并将背部及腹部皮肤连续缝合。
骨髓移植
小鼠经致死辐照（cGy）后，经静脉注射6x个骨髓细胞建立嵌合体。骨髓移植8周后进行下一步实验。
经小脑延髓池穿刺注射hypocretin-1
细胞
细胞收集
小鼠后眼眶采血，利用红细胞裂解液裂解红细胞。PBS灌注后，分离小鼠主动脉、肺、肝脏和心脏，剪碎后，利用含有Uml-1Ⅰ型胶原酶Uml-1Ⅺ型胶原酶，60Uml-1脱氧核糖核酸酶Ⅰ和60Uml-1透明质酸酶（Sigma-Aldrich)的裂解液37℃消化20分钟（肝脏），40分钟（主动脉），1h（心脏和肺）。
细胞分选
根据免疫表型对骨髓细胞悬液进行染色后，利用FACSAriaⅡcellsorter（BDBiosciences）流式细胞仪进行细胞分选。
流式细胞术
BrdU掺入实验
为了检测细胞增殖，处死小鼠前2小鼠腹腔内注射1mgBtdU，利用BrdU流式试剂盒（BDBiosciences）对BrdU+细胞进行染色。
RNA和蛋白相关实验
聚合酶链式反应
酶联免疫吸附
根据产品说明书，使用酶联免疫吸附试验（ELISA)试剂盒分别检测下hypocretin-1水平和CSF1(M-CSF)水平。取骨髓液进行骨髓ELISAs检测。
免疫印迹
细胞培养
利用流式细胞仪（FACSAriaⅡ)对中性粒细胞进行分选，将5x个下壁重悬于0.5ml培养液并接种至48孔板。之后利用1uMhypocretin-1和20ngml-1LPS处理细胞3小时。收集细胞和培养基进行后续分析。
髓样细胞集落形成单位测定
制备骨髓细胞单细胞悬浮液，根据产品说明书，将2x细胞培养于含有后不含hypocretin-1的完全甲基纤维素培养基（MeghoCultGFM）中，3个复孔。在37℃、5%CO2培养箱中培养11天后计数集落形成单位。
组织学和uCT
主动脉
分离主动脉根，并制作冰冻切片。
油红O（SigmaAldrich）染色观察脂质含量并测量粥样病变大小。利用Nanozoomer2.0RS(Hamamatsu）测量病变大小。总之，通过测量内膜从内皮层到正常中层的动脉粥样硬化斑块来量化病变区面积。
脑
收集全脑并进行固定后制作石蜡标本。
骨
行为学分析
旷场实验
将小鼠分别置于50cmx50cm的旷场中央，在环境光照下放置5分钟，操作软件进行记录分析。分析小鼠在距离盒子边缘5cm以内区域滞留时间。
明暗箱实验
明暗箱（25cmx25cm）分为明箱和暗箱两部分，两箱之间的隔墙有一个门洞，去除门洞隔板后小鼠可以在两箱之间自由穿梭。将小鼠置于明暗箱的暗侧，去除门洞隔板，同时进行摄像和计时，记录时间为5分钟。观察小鼠在明箱中停留时间。
Y迷宫
新异臂被隔板挡住，小鼠由起始臂放入，在起始臂和其他臂自由活动5分钟，训练结束后，小鼠被放回饲养笼。20分钟后进行第二阶段即检测期的实验，抽去新异臂的挡板，小鼠由起始臂放入，在3个臂自由探索活动5分钟。录像记录5分钟内每只小鼠在各个臂停留的时间，ImagJ软件对小鼠的行为表型进行定量分析。
统计学分析
结果
为了迎接睡眠预防心血管疾病的具体机制，我们给予有动脉粥样硬化倾向的Apoe-/-小鼠睡眠片段化（SF)干预（扩展数据图1A，补充视频1）。
我们发现，SF对Apoe-/-小鼠的体重，血清胆固醇和葡萄糖耐受性无影响（扩展数据图1B-E）；然而，与未进行SF干预的对照组Apoe-/-小鼠相比，Apoe-/-SF小鼠在SF干预12、16周的粥样硬化斑块面积显著增大（图1A）。此外，不仅Apoe-/-SF小鼠的粥样硬化病变体积显著性增加（图1B），而且流式细胞术结果显示，Apoe-/-SF显示主动脉Ly-6Chigh单核细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的数量也显著性增加(图1C）。
图1.睡眠片段化加剧了动脉粥样硬化，促进造血作用，降低了下视丘分泌素（HCRT）的水平。
给予Apoe-/-小鼠高脂膳食，并进行睡眠片段化（SF）干预。分别对SF干预后8,12及16周的小鼠主动脉根横切面粥样硬化斑块进行油红O染色，与未进行SF干预的对照组Apoe-/-小鼠相比，Apoe-/-SF小鼠在SF干预后12,16周的粥样硬化斑块面积显著增大（图1A-B）。此外流式细胞术结果显示，Apoe-/-小鼠主动脉Ly-6Chigh单核细胞、中性粒细胞和巨噬细胞的数量显著性增加（图1C）。白细胞增多是心血管疾病的先兆，尽管小鼠血液中的骨髓细胞数量根据昼夜节律波动，在授时因子时间（ZT）5达到峰值，在ZT14达到最低值，但是SF显著增加了小鼠在光照环境期间的循环Ly-6Chigh单核细胞和中性粒细胞数量，节律特征分析显示循环Ly-6Chigh单核细胞和中性粒细胞数量的昼夜节律振幅增加（图1D）。接下来本研究检测了SF对Apoe-/-小鼠造血作用的影响。流式细胞术结合BrdU掺入实验发现，SF促进了骨髓Linp-Kit+Sca1+（LSK)造血祖细胞的增殖，增殖能力的增强导致骨髓中LSK细胞数量增加了约两倍（图1E），提示SF促进了髓系造血。接下来，本试验将重点集中在下丘脑，特别是那些编码睡眠调节相关蛋白转录本的表达。对SF干预16周后下丘脑进行免疫组化及qRT-PCR分析显示，SF显著降低了下丘脑中下视丘分泌素（Hcrt，也称orexin)的表达（图1F-H)，与血浆和骨髓中同型Hcrt-1水平的降低抑制（图1）。
白细胞增多是心血管疾病的先兆，尽管小鼠血液中的骨髓细胞数量根据昼夜节律波动，在授时因子时间（ZT)5达到峰值，在ZT14达到最低值，但是SF显著增加了小鼠在光照环境期间的循环Ly-6Chigh单核细胞和中性粒细胞数量（图1D）。
接下来，本研究检测了SF对Apoe-/-小鼠造血作用的影响。SF促进了骨髓Lin-Kit+Sca1+(LSK)造血细胞的增殖，导致骨髓中LSK（图1E）及其他祖细胞的数量增加了约两倍（扩展数据3A）。
以上结果说明，SF促进了髓系造血。
接下来，我们将注意力集中在下丘脑，特别是那些编码睡眠调节相关蛋白转录本的表达（扩展数据图5H-J）。对SF干预16周后下丘脑进行免疫组化及qRT-PCR分析显示，SF显著性降低了下丘脑中下视丘分泌素（Hcrt，也称为orexin）的表达（如1F-H），与血浆和骨髓中同型Hcrt-1水平的降低抑制(图1I）。
敲除HCRT严重破坏了小鼠睡眠-觉醒周期，可导致猝倒，并促进进食源性肥胖的发生。此外，敲除HCRT受体-2使小鼠心肌梗死后愈合恶化。因此，我们分析了Hcrt-/-小鼠的白细胞水平，流式细胞术结果发现与WT对照组相比，Hcrt-/-小鼠血液、脾脏和骨髓中的Ly-6Chigh单核细胞和中性粒细胞水平显著升高（图2A-B）。
Hcrt-/-小鼠骨髓中造血细胞数量增加，LSK细胞增殖能力显著增强（图C，扩展数据图7）。与SF小鼠一样，Hcrt-/-小鼠的造血作用加速并不依赖于微生物组（扩展数据图4D）。这些结果表明，睡眠通过下视丘分泌素调节造血功能。
图2.下视丘分泌素具有脂质这些和动脉粥样硬化的功能。
人血浆HCRT水平的降低增加了患心肌梗塞、心力衰竭和肥胖的几率。敲除HCRT严重破坏了小鼠睡眠-觉醒周期，可导致猝倒，并促进进食源性肥胖的发生。此外，敲除HCRT受体-1使小鼠心肌梗死后愈合恶化。因此，我们分析了Hcrt-/-小鼠的白血病水平，流式细胞术结果发现，与WT对照组相比，Hcrt-/-小鼠血液、脾脏和骨髓中的Ly-6Chigh单核细胞和中性粒细胞水平显著升高（图2A，B）。节律特征分析显示，Hcrt-/-小鼠血液Ly-6Chigh单核细胞和中性粒细胞数量的昼夜节律振幅加大。流式细胞术结合BrdU掺入实验结果显示，Hcrt-/-小鼠骨髓中造血祖细胞数量增加，LSK细胞增殖能力显著增强）图2C）。接下来，为了检测HCRT对造血和动脉粥硬化的影响，本研究构建了非造血组织（包括下丘脑）或造血细胞缺乏HCRT的嵌合小鼠（图2D），并发现一只WT小鼠骨髓进行骨髓重建的Hcrt-/-小鼠的作用显著增加（图2E）。本研究还利用Hcrt-/-小鼠与野生型小鼠构建联体共生模型（图2F），发现与Hcrt-/--Hcrt-/-小鼠联体共生相比，WT-Hcrt-/-小鼠联体共生显著抑制了造血作用（图2G）。这些结果表明，下丘脑产生的下视丘分泌素可进入循环系统影响远端骨髓的造血作用。为了确定下视丘分泌素缺失是否会加重动脉粥样硬化，我们构建了Hcrt-/-Apoe-/-小鼠，与Ppoe-/-对照组相比，Hcrt-/-Apoe-/-小鼠的主动脉粥样硬化包括更大（图2H，主动脉根部横断面油红O染色），白细胞聚集更多（图2I，Ly-6Chigh单核细胞、中性粒细胞和巨噬细胞水平显著升高）。
为了检测下视丘分泌素对造血作用和动脉粥样硬化的影响，本研究构建了非造血组织（包括下丘脑）或造血细胞缺乏下视丘分泌素的嵌合小时（图2D），并发现移植WT小鼠骨髓进行骨髓重建的Hcrt-/-小鼠的造血作用显著增加（图2E）。本研究还利用Hcrt-/-小鼠与野生型小鼠构建联体共生模型（图2F），发现与Hcrt-/--Hcrt-/-小鼠联体共生相比，WT-Hcrt-/-小鼠联体共生显著抑制了造血作用（图2G)。
这些结果表明，下丘脑产生的Hypocretin可进入循环系统影响远段骨髓的造血作用。为了确定下视丘分泌素缺失是否会加重动脉粥样硬化，我们构建了Hcrt-/-Apoe-/-小鼠，与Apoe-/-对照组相比，Hcrt-/-Apoe-/-小鼠的主动脉粥样硬化斑块更大（图2H，主动脉根部横断面油红O染色），白细胞聚集更多（图2I，Ly-6Chigh单核细胞，中性粒细胞和巨噬细胞水平显著升高）。
在确定了下视丘分泌素、造血和动脉粥样硬化之间的联系后，我们对其潜在作用机制进行研究。首先，我们对骨髓中14种不同的细胞类型进行下视丘分泌素受体-1（HCRTR1)含量测定（qRT-PCR)，发现中性粒细胞（而非其他细胞）表达Hcrtr1mRNA(图3A）和HCRTR1蛋白，对不同成熟期中性粒细胞进行分选，发现前体中性粒细胞（pre-neutrophils）高表达Hcrtr1（图3B）。
使用Hcrtr1GFP/GFP小鼠模型，流式细胞术结果发现骨髓来源的前体中性粒细胞表达GFP，因此也表达HCRTR1（图3c，扩展数据图9B）。
图3.说明下视丘分泌素调控骨髓前中性粒细胞产生CSF1。
在确定了下视丘分泌素、造血和动脉粥样硬化之间的联系后，我们对其潜在作用机制进行研究。首先，我们对骨髓中14种不同的细胞类型进行下视丘分泌素受体-1（HCRTR1）含量测定（qRT-PCR），发现中性粒细胞（而非其他细胞）表达Hcrtr1mRNA(图3A）和HCRTR1蛋白。接下来利用流式细胞术对不同成熟期中性粒细胞进行分选，发现前体中性粒细胞（pre-meutrophils）高表达Hcrtr1(图3B）。使用Hcrtr1GFP/GFP小鼠模型，流式细胞术结果发现骨髓来源的前体中性粒细胞表达GFP，因此也表达HCRTR1（图3）。此外，qRT-PCR结果发现，中性粒细胞可产生大量集落刺激因子-1（CSF1，具有促进髓系造血的作用）（图3D）。对不同成熟期中性粒细胞进行Csf1mRNA分析发现，成熟中性粒细胞高表达Csf1mRNA（图3E）。接下来，我们探讨下下视丘分泌素是否通过调控HCRTR1+前体中性粒细胞CSF1的产生来抑制造血作用。体外细胞实验结合ELISA结果发现，下视丘分泌素具有抑制LPS诱导的前体在行李箱产生CSF-1的作用（图3F）。离体实验（Exvivo)结合ELISA检测发现，与野生型小鼠相比，Hcrt-/-小鼠来源前体中性粒细胞和中性粒细胞表达更多的Csf1mRNA，并分泌更多的CSF1蛋白（图3G）。体内实验发现Hcrt-/-小鼠和Apoe-/-SF小鼠骨髓CSF1水平显著升高（图3H）。由于骨髓非造血细胞不表达HCRTR1(图3A）但分泌CSF1（图3D），接下来我们对下视丘分泌素调控白细胞来源CSF1的作用进行分析。首选，将野生型或Hcrt1条件敲除（Hcrtr1GFP/GFP)小鼠的骨髓细胞移植到经致死辐照的野生型小鼠体内。结果发现，接受Hcrtr1GFP/GFP骨髓移植的嵌合体小鼠的Ly-6Chigh单核细胞增多（图3I），LSK细胞数量增加，增殖能力增强（图3J），骨髓CSF1水平增加（图3K）。其次，我们将Hcrtr1GFP/GFP骨髓移植到Ldlr-/-小鼠体内，发现其动脉粥样硬化加重（图3I）。
值得注意的是，骨髓CXCR4+CXCR2-前体中性粒细胞表达Hcrtr1，因为这些细胞位置上最靠近造血祖细胞。此外，qRT-PCR结果发现，中性粒细胞可产生大量集落刺激因子-1（CSF1，具有促进髓系造血的作用）（图3D）。
对不同成熟期中性粒细胞进行Csf1mRNA分析发现，成熟中性粒细胞高表达Csf1mRNA(图3E）。
接下来，我们探讨下视丘分泌素是否通过调控HCRTR1+前体中性粒细胞CSF1的产生来抑制造血作用。体外细胞实验结合ELISA结果发现，下视丘分泌素具有抑制LPS诱导的前体中性粒细胞产生CSF-1的作用（图3F，扩展数据图9C）。离体实验（Exvivo)结合ELISA检测发现，与野生型小鼠相比，Hcrt-/-小鼠来源前中性粒细胞和中性粒细胞表达更多的Csf1mRNA，并分泌更多的CSF1蛋白（图3G，扩展数据图9D）。体内实验发现Hcrt-/-小鼠和Apoe-/-SF小鼠骨髓CSF1水平显著性升高（图3H）。
由于骨髓非造血细胞不表达HCRTR1（图3A）但分泌CSF1（图3D），接下来我们对下视丘分泌素调控白细胞来源CSF1的作用进行分析。
首先，将野生型或Hcrt1条件敲除（Hcrtr1GFP/GFP)小鼠的骨髓细胞移植到经致死辐照的野生型小鼠体内。结果发现，接受Hcrtr1GFP/GFP骨髓移植的嵌合体小鼠的Ly-6Chigh单核细胞增多（图3J），骨髓CSF1水平增加（图3K）。
其次，我们将Hcrtr1GFP/GFP骨髓移植到Ldlr-/-小鼠体内，发现其动脉粥样硬化加重（图3I）。
第三，我们对野生型或Hcrt-/-小鼠进行致死辐照，并接受野生型或Csf1-/-小鼠的骨髓细胞移植（扩展数据图10A）。不出所料，无论来自何种骨髓来源，野生型小鼠的Ly-6Chigh单核细胞相对较少。
上述结果支持我们提出的假设，即下视丘分泌素通过介导前体中性粒细胞产生CSF1来抑制单核细胞增多和动脉粥样硬化进展。
抑制造血细胞来源CSF1或补充下视丘分泌素可抑制睡眠片段化导致的造血作用和动脉粥样硬化。最后，本研究探讨了下视丘分泌素在睡眠片段化致动脉粥样硬化中的作用。我们将野生型或Csf1-/-骨髓抑制到Ldlr-/-小鼠体内，并给予嵌合体小鼠睡眠片段化干预（图4A）。
接受野生型骨髓抑制的Ldlr-/-小鼠在进行睡眠片段化干预后出现因造血作用增强导致的单核细胞增多现象，具体表现为，LSK细胞增殖能力加强，骨髓CSF1水平升高，上述变化共同导致动脉粥样硬化斑块面积增加。而接受Csf1-/-骨髓抑制的Ldlr-/-小鼠由于骨髓CSF1表达下降，上述指标均显著降低（图4B-E）。
此外，我们还将hypocretin注射到经睡眠片段化干预的Apoe-/-小鼠体内（图4F）。发现，与对照组Apoe-/-SF小鼠相比，接受下视丘分泌素治疗的Apoe-/-SF小鼠血液中的单核细胞和中性粒细胞数量减少（流式细胞术，图4G），骨髓LSK数量和增殖能力降低（图4H），骨髓CSF1水平降低（图4I）和主动脉粥样硬化斑块面积减小（主动脉根横断面油红O染色，图4J）。上述结果表明，下视丘分泌素具有抑制睡眠片段化导致的髓系造血和动脉粥样硬化作用。
图4.说明抑制造血细胞来源CSF1或补充下视丘分泌素可抑制睡眠片段化导致的造血作用和动脉粥样硬化。
最后，本研究探讨了下视丘分泌素在睡眠片段化致动脉粥样硬化中的作用。我们将野生型或Csf1-/-骨髓移植到Ldlr-/-小鼠体内，并给予嵌合体小鼠睡眠片段化干预（图4A）。接受野生型骨髓移植的Ldlr-/-小鼠在进行睡眠片段化干预后出现因造血作用增强导致的单核细胞增多现象，具体表现为，LSK细胞增殖能力加强，骨髓CSF1水平升高，上述变化共同导致动脉粥样硬化斑块面积增加。而接受Csf1-/-骨髓移植的Ldlr-/-小鼠由于骨髓CSF1表达下降，上述指标均显著降低（图4B-E）。此外，我们还将下视丘分泌素注射治疗的Apoe-/-SF小鼠血液中的单核细胞和中性粒细胞数量减少（流式细胞术，图4G），骨髓LSK数量和增殖能力降低（图4H），骨髓CSF1水平降低（图4I）和主动脉粥样硬化面积减小（主动脉根部横断面油红O染色，图4J）。上述结果表明，下视丘肺毛细具有抑制睡眠片段化导致的髓系造血和动脉粥样硬化作用。
我们对数据表明睡眠可以预防动脉粥样硬化。睡眠不受干扰时，下丘脑会释放适量的下视丘分泌素，抑制骨髓前体中性粒细胞分泌CSF1，从而减少造血和抑制动脉粥样硬化。这个神经-免疫轴直接将睡眠与免疫功能和心血管疾病联系起来。
1.Hublin,C.,Partinen,M.,Koskenvuo,M.Kaprio,J.Sleepandmortality:apopulation-based22-yearfollow-upstudy.Sleep30,–3().2.Cappuccio,F.P.,Cooper,D.,D’Elia,L.,Strazzullo,P.Miller,M.A.Sleepdurationpredictscardiovascularout
